508号室に設置の【 InsituProVS 】を用い、 whole mount in situ hybridization処理行程中の PreHybri ～抗体反応について支援を行います。
固定→脱水→ (保存)→再水和(漂白)→ Proteinase K 処理・・・各自で行ってください
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PreHybri→Probe Hybridization→RNAse 処理→抗体反応・・・支援行程 (約３日間。この行程中の試薬等もこちらが準備します)
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発色 (染色)反応・・・各自で行ってください
実施の１～ 2週間前までに、メールにて依頼・日程等の打ち合わせ
(こちらの都合により日程をずらしていただく可能性もあります)
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当日、サンプルとプローブを受け取り
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処理後、サンプルを返却
※当面はE11.5以降のマウス胚について受け付けます。
(以下のプロトコルで結果確認済み)
その他のサンプルについてはご相談ください。
<whole mount in situ hybridizationプロトコル>
sample：マウス胚 E11.5
前処理 (各自)
brain, heart などに穴をあける 27G
4 ％ PFA 4Co O/N
PBST 4Co 5min×2
25 ％ MeOH/PBST 5min (0.1% tween 20)
50 ％ MeOH/PBST 5min
75 ％ MeOH/PBST 5min
100 ％ MeOH 5min×1, 10min×1
-20Co 保存 (水を完全に置換する)
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サンプル提出当日の処理 (各自)
75 ％ MeOH/PBST 5min 4Co
50 ％ MeOH/PBST 5min 4Co
25 ％ MeOH/PBST 5min 4Co
PBST 5min×2 4Co
(6 ％ H2O2 /PBST 1hr 4Co)
PBST 5min×3 r.t.
10μg/ml ProK/PBST 12min r.t. (stageによって要変更)
2mg/ml glycin/PBST 20 ～ 30sec 4Co
0.2 ％ glutalaldehyde/4 ％PFA 20min 4Co
PBST 5min× 2 4Co
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サンプルとプローブを提出 ( Probe : 100ng/μl -20Co)
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【 InsituProVS 】 処理
PBST 45min
PBST 0min
Hyb-Buffer 1 10min r.t.
Hyb-Buffer 1 45min r.t.
Hyb-Buffer 1 1h 65Co
Probe in Hyb.Buffer 1 16h 65Co
Hyb-Buffer 2 45min×3 65Co
Hyb-Buffer 2 20min 37Co
Hyb-Buffer 2 0min 37Co
RNAse Buffer 0min 37Co
RNAse 1h 37Co
RNAse Buffer 45min 37Co
RNAse Buffer 0min 37Co
S2-Buffer 10min 37Co
S2-Buffer 45min×2 65Co
S2-Buffer 0min r.t.
PBST 0min r.t.
PBST 45min r.t.
MABT 45min×4 r.t.
Blocking 1h r.t.
Antibody 6h r.t.
MABT 45min×12 r.t.
※各行程の条件は依頼者の要望によって変更可能です。
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サンプル返却
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染色 (各自)
MABT この状態で返却します
NTMT
NBT/BCIP /NTMT 10μl/ml (＋200mM Levamisole)
遮光・r.t.
30min おきに染色確認
TE 5min×4 染色Stop
観察＆Photo
TEのまま保存(4℃)
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MeOH脱色
25 ％ MeOH/PBST 5min (0.1% tween 20)
50 ％ MeOH/PBST 5min
75 ％ MeOH/PBST 5min
100 ％ MeOH 5min
脱色が不足していればO/N (4℃)
保存(-20℃)
